第358章 将军与公主（番外）

　　(1)液体浅层培养：纯化后的原生质体悬浮于液体培养基中，取少许于培养皿底部形成很薄的一层，封口进行培养。


　　优点：操作简单，易于添加新鲜培养基。


　　缺点：原生质体容易发生粘连，难于定点观察。


　　(2)固体培养：也叫琼脂糖平板法或包埋培养法。将原生质体悬浮于液体培养基后，与凝固剂（主要是琼脂或低熔点琼脂糖）按一定比例混合，在培养皿底部形成一薄层，凝固后封口培养。


　　优点：便于观察，有利于减少有害释放物的影响


　　(3)固液双层培养法：在培养皿底部先铺一层固体培养基，待凝


　　固后再在其上进行液体浅层培养。


　　优点：固体培养基中的营养成分可以被液体层中的原生质体吸收利用，而原生质体产生的有毒物质可以被固体培养基吸收


　　原生质体融合（体细胞杂交）有哪些主要应用


　　（1）突破生殖障碍，克服有性杂交不亲和，创造新异核体细胞杂种


　　（2）转移优异农艺性状，创造新的种质材料


　　（3）选择性转移胞质基因和基因组，创造胞质杂种，研究质核互作和体细质基因遗传


　　原生质体融合有哪些方法


　　（1）自发融合：酶解细胞壁过程中，有些相邻的原生质体彼此融合形成同核体。来源于分裂旺盛细胞的原生质体，自发融合的频率较高


　　（2）化学融合：NaNO3法、高pH-高钙法、聚乙二醇（PEG）诱导法、多聚化合物法


　　（3）电场诱导法（细胞电融合，主要是双向电泳法）：原生质体接触－质膜融合－圆球化－核融合


　　优点：避免化学物质的潜在毒害


　　融合率：与原生质体来源、体积、链的长度、脉冲持续时间及电压等因素有关。


　　激光诱导法


　　基于微流控芯片的细胞融合


　　（6）高通量细胞融合芯片


　　（7）其他细胞融合技术：如离子束细胞融合


　　技术


　　PEG诱导原生质体融合的可能机制是什么


　　简述几种主要原生质体融合方式的特点


　　（1）对称融合：是亲本原生质体在融合前未进行任何处理的一种融合方式。它综合双亲的全部性状。在导入有利性状的同时，也不可避免地带入了一些不利性状。


　　（2）非对称融合：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合的方式


　　原生质体融合的主要产物有哪些，各有什么作用


　　（1）对称杂种：指杂种中具有融合双亲全部的核遗传物质


　　（2）非对称杂种：指双亲或其中一方的核遗传物质出现了丢失


　　（3）胞质杂种：非对称杂种的一种，融合一方的核物质完全丢失，并且具有双方的细胞质遗传物质


　　异质杂种：胞质杂种的一种。指杂种的细胞核来源于一方，而细胞质来自于另一方


　　体细胞杂种的筛选和鉴定方法有哪些，哪一种最有效


　　（1）形态学鉴定：杂种在形态上往往介于双亲之间，包括株型、叶形、花器官等


　　（2）细胞学鉴定


　　染色体观察：染色体数目是双亲之和，或少1至几条染色体；细胞融合可以创造非整


　　倍体、代换系、染色体片段置换系等材料


　　流式细胞仪倍性分析：利用细胞倍性检测仪可以粗略地分析杂种细胞的倍性，一般与


　　双亲对照分析，测出的杂种的DNA含量基本是双亲之和。


　　（3）分子标记鉴定：最有效的检测手段，能检测出遗传物质的细重组


　　（4）荧光原位杂交（FISH）鉴定：鉴定异源染色体的重组情况，将重组片段定位在染色体上。


　　（5）蛋白质电泳分析：从基因表达产物判断真假杂种，一般应有双亲作对照，可以对多种蛋白作分析


　　最有效的是：分子标记鉴定


　　II类(型)限制性核酸内切酶有何特点？


　　（1）能够识别特异性的DNA识别位点，这种识别位点通常是具有双链回文对称的结构。


　　（2）切割后形成的双链DNA分子能够彼此互补并能够重新连接。


　　（3）切割和修饰功能由2种不同的酶催化所完成。


　　（4）不需要腺苷甲硫氨酸）作为活性辅助因子。


　　2、比较质粒载体、λ噬菌体载体和粘粒（Cosmid）载体的特点。


　　质粒载体：（1）自主复制（2）质粒DNA的结合性


　　λ噬菌体载体：（1）λ噬菌体载体是一种可在体外包装的细菌病毒，可高效感染大肠杆菌（2）基因组为长度约为50kb的双链DNA分子（3）基因组DNA呈线性，其两赌5’末端带有12个碱基的互补单链（粘性末端，cos位点）（4）溶源状态：整合到大肠杆菌染色体，随之复制（5）溶菌状态：进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状DNA分子，并随宿主细胞复制，经过n的生长循环，释放出约100个感染性噬菌体颗粒，裂解大肠杆菌完成自我包装。


　　粘粒载体：（1）具有λ噬菌体的特性（cos位点）：被包装后能高效转化E.coli（2）具有质粒载体的特性：自主复制，带有抗性标记，易于选择阳性克隆（3）高容量的克隆能力：可载高达（4）因不含δ基因，故不会裂解（5）便于定向克隆


　　何为人工染色体载体？


　　人工构建的含有然染色体基本功能单位的载体体系。


　　酵母人工染色体（YAC)


　　①存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两个本来不相连的独立片段；


　　部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发生缺失或重排；


　　难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色体具有相似的结构；


　　操作时容易发生染色体机械切割；


　　转化效率低。


　　细菌人工染色体（BAC）


　　易于用电击法转化E.coli（转化效率比转化酵母高10-100倍）；


　　超螺旋环状载体，易于操作；


　　F'质粒本身所带的基因控制了质粒的复制；


　　很少发生体内重排。


　　（3）其它类型的人工染色体（）


　　－P1人工染色体(）


　　－植物可转基因人工染色体


　　常用的基因克隆方法有哪几类？各有什么特点？实际应用中有什么要求？


　　以已知序列为基础的基因克隆方法


　　以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法


　　以人工突变体为基础的基因克隆方法


　　以表达差异为基础的基因克隆方法


　　利用生物大分子之间相互作用的基因克隆方法。


　　5、什么是基因文库？基因文库有哪两类？


　　6、用于植物遗传转化的生物载体有哪两类？


　　（1）病毒载体：


　　?单链RNA植物病毒


　　?单链DNA植物病毒


　　?双链DNA植物病毒


　　（2）质粒载体：


　　?Ti质粒（根瘤土壤杆菌）


　　?Ri质粒（毛根土壤杆菌）


　　7、根癌农杆菌为何能诱发植物冠瘿瘤形成？


　　8、Ti质粒的主要结构区域和功能。


　　（1）毒性区（vir区）：激活的转移


　　（2）T－DNA区：侵染植物时，从Ti质粒上被切割，转移到植物细胞中，带有与肿瘤形成


　　有关的基因


　　（3）质粒接合转移区（Con区）：存在与细菌间进行接合有关的基因


　　（4）质粒复制起始区（Ori区）：保证Ti质粒进行自我复制。


　　（5）冠瘿碱分解位点


　　9、T-DNA的结构和功能。


　　结构：（1）一般在23kb左右，都含有一段8kb左右的核心区（2）在T-DNA的5’端和3’端都有真核表达信号，如(A)n等（3）无内含子（4）含致瘤基因（激素合成有关的基因）（5）含冠瘿碱合成代谢基因（6）左边界、右边界（RBandLB)序列（对T-DNA转移的重要性：右边界更保守）


　　功能：侵染植物时，从Ti质粒上被切割，转移到植物细胞中，带有与肿瘤形成


　　有关的基因


　　Vir区的主要结构和功能。


　　总长度大约35kb，由7个互补群组成，分别命名为、、和VirH


　　VirA


　　结构：单一基因，2.8kb，编码1条92kDa的多肽，为一种结合在膜上的受体蛋白（周质结构域，接头结构域，激酶结构域，接收器结构域）；VirA蛋白C端保守区可以进行ATP特异性自发磷酸化（磷酸化的位点在474位组氨酸残基上，形成稳定的1-磷酸组氨酸和3-磷酸组氨酸）；磷酸化的VirA蛋白能激活VirG蛋白（通过转移其磷酸基团至VirG蛋白的一个冬氨酸残基）


　　功能：帮助植物细胞接受植物信号分子，启动毒性区表达


　　VirG


　　结构：1.2kb，为单拷贝基因，编码DNA结合活化蛋白；位于VirG蛋白N囤52位的冬氨酸可以被磷酸化形成酰基磷酸（VirG蛋白必须在VirA蛋白存在下才能够特异性地


　　磷酸化）


　　功能：转录因子。可以特异地结合到VirB、C、D、E、G和H操纵子的5’端非转录区，激活转录


　　VirB


　　结构：至少编码11个开放阅读框架，编码膜转园白。


　　蛋白质的N端带有信号序粒这种序列可以帮助蛋白质在膜上的运输，使其独立地或借助类似分子伴侣受体的帮助穿过内膜。


　　功能：可能是通过改变细菌细胞膜的结构，产生一个膜穿透通道，使T-DNA转移到细菌细胞外；也可能作为T-DNA复合物的组成成分。


　　VirC


　　功能：VirC1可以和T-DNA末端序列外侧的增强驱动子序列结合。可以提高土壤农杆菌的致瘤性（通过提高VirD操纵子在T-DNA末端序列特异位点的缺刻式切割能力来实现）；VirC2的功能目前尚不清楚。


　　VirD基因家族（1-4）


　　分别编码分子质量约为16.2、47.4、21.3和5.8kDa的四种不同的蛋白质分子，均与T-DNA加工有关。


　　VirD1：编码一种DNA松驰酶。


　　VirD2：①具N赌T-DNA末端切割能力；②含有核定位信号。A共价结合后，可以引导复合物向植物细胞核方向运动。


　　VirD3：功能尚不清楚。不同类型的农杆菌菌种之间VirD3蛋白的同源性很。


　　VirD4：N端带有一段信号肽序列，引导蛋白转越细胞内膜。


　　VirE


　　编码的VirE2蛋白质是一种单链DNA结合蛋白。


　　功能：VirE2以共价的方式与经过加工的T-DNA分子的5’末端结合，形成T-复合物，以保护其免受核酸酶的降解。


　　VirF


　　可能的功能：协助T-DNA转移到宿主植物细胞中


　　VirH


　　功能：可能对植物产生的某些杀菌或者抑菌化合物起解毒作用，从而使农杆菌的生长不受这些物质的抑制


　　Tzs


　　编码与玉米素有关的细胞分裂素异戊（间）二烯基转移酶，可将玉米素分泌到细胞外（玉米素能促进农杆菌感染部位的植物组织脱分化和细胞分裂）


　　T-DNA整合到植物核基因组的必要条件。


　　（1）T-DNA边界序列


　　（2）Vir区基因


　　（3）农杆菌染色体上的基因


　　12、共整合载体系统的工作原理。


　　（1）农杆菌和大肠杆菌两个质粒具有一同源区


　　（2）两个质粒接合后经过同源重组形成一个大的共整合质粒


　　（3）将欲导入植物的外源基因在大肠杆菌中进行克隆和操作，与农杆菌Ti质粒同源重组后，此外源基因就定位于两个T-DNA边界序列之间


　　（4）大肠杆菌质粒不能在农杆菌中进行自主复制，所以不经过重组就无法在农杆菌中稳定存在


　　13、双元载体系统的工作原理。


　　（1）有辅助质粒和穿梭质粒组成


　　（2）辅助质粒：含有为T-DNA转移所必须的Vir区段，提供毒性基因功能；含有农杆菌复制起始子；没有T-DNA边界序粒


　　（3）穿梭质粒：具有A边界重复序列；广谱寄主范围复制功能和移动功能；细菌选择标记，如卡那霉素抗性基因；最近构建的穿梭载体携带有cosI复制起始子(来自


　　pBR322)，所以可大量制备质粒；编码植物选择标记、表达信号，T-DNA边界序列；有用于外源基因亚克隆的多克隆位点


　　（4）两种质粒在单独存在的情况下都不具备诱发肿瘤的功能


　　（5）接合后，两个质粒在选择压下可以自主共存于同一农杆菌细胞郑当农杆菌感染受赡植物时，Ti质粒上的Vir基因与穿梭质粒上的右边界序列发生反式相互作用，从而将T-DNA转移进入植物细胞。


　　14、比较共整合载体系统和双元载体系统的特点。


　　共整合载体系统：


　　双元载体系统：（1）由两个彼此相容的质粒组成，两个质粒可以自主共存在同一农杆菌细胞中（基本特点）


　　（2）不需体内重组


　　（3）仅需将一个质粒转入细菌


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